В ходе выполнения проекта «Разработка конъюгированной вакцины нового поколения для обеспечения высокоэффективной профилактики брюшнотифозной инфекции» по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 №14.604.21.0067 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапах №1-5 в период с 27.06.2014 по 31.12.2016 выполнялись следующие работы:

• Аналитический обзор информационных источников, обоснование и выбор методов и средств, направления исследований и способов получения вакцинных конъюгатов на основе рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа;
• Теоретическое исследование путей создания вакцины, основанной на применении рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа (теоретическое обоснование отбора белков-партнёров для создания конъюгатной вакцины, дизайн последовательностей, кодирующих белковые антигены-партнёры для конъюгации с учётом кодонной оптимизации трансляции и обеспечения эффективной технологии очистки рекомбинантного белкового антигена-партнёра);
• Получение и очистка Vi-антигена из S. typhi;
• Изучение физико-химических характеристик и оценка пирогенности Vi-антигена S. typhi;
• Экспериментальное исследование иммуногенных и протективных свойств Vi-антигена S. typhi при иммунизации животных;
• Получение штаммов-продуцентов рекомбинантных белковых антигенов-партнёров для конъюгации;
• Наработка и очистка рекомбинантных белковых антигенов-партнёров для конъюгации;
• Изучение физико-химических характеристик и оценка пирогенности рекомбинантных белковых антигенов-партнёров для конъюгации;
• Сравнительная оценка вариантов возможных способов получения конъюгированной вакцины на основе рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа с учетом результатов исследований, проводившихся по аналогичной тематике;
• Разработка нового технического принципа создания конъюгированной вакцины на основе рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа;
• Разработка экспериментального образца конъюгированной брюшнотифозной вакцины нового поколения, основанной на использовании химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном – стимулятором иммунного ответа;
• Разработка методики оценки эффективности конъюгации и качества конъюгатов;
• Анализ эффективности конъюгации и выхода конъюгата, пригодного для проведения иммунизации;
• Получение экспериментальных образцов конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном – оптимальным стимулятором иммунного ответа;
• Иммунизация лабораторных животных экспериментальными образцами конъюгированной брюшнотифозной вакцины;
• Разработка методики анализа иммунного ответа при иммунизации экспериментальными образцами конъюгированной вакцины;
• Проведение экспериментальных исследований иммунного ответа, вызванного применением химических конъюгатов различных рекомбинантных белков-иммуностимуляторов с Vi-антигеном S. typhi;
• Проведение исследовательских испытаний протективного эффекта экспериментальных образцов брюшнотифозной вакцины;
• Установление наиболее эффективного препарата-кандидата конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном-стимулятором иммунного ответа по результатам обработки данных по иммуногенности и протективности;
• Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.

За счет внебюджетных средств проекта проводились:

• Материально-техническое обеспечение выполнения прикладного научного исследования (ПНИ);
• Реализация мероприятий по достижению показателей результативности предоставления субсидии.

При этом были получены следующие результаты:

На этапе 1 выполнения проекта был проведен аналитический обзор информационных источников, обоснование и выбор методов и средств, направления исследований и способов получения вакцинных конъюгатов на основе рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа и теоретическое исследование путей создания вакцины, основанной на применении рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа (теоретическое обоснование отбора белков-партнёров для создания конъюгатной вакцины, дизайн последовательностей, кодирующих белковые антигены-партнёры для конъюгации с учётом кодонной оптимизации трансляции и обеспечения эффективной технологии очистки рекомбинантного белкового антигена-партнёра).

Получено 2 серии препарата (5 и 7) Vi-антигена S. typhi. Составлена лабораторная методика наработки и очистки Vi-антигена S. typhi, и проведено изучение физико-химических характеристик Vi-антигена S. typhi. Экспериментальное исследование иммунологических и протективных свойств Vi-антигена S. typhi при иммунизации животных показало, что развитие гуморального иммунного ответа после введения мышам Vi-антигена S. typhi в дозе 25 мкг/мышь имеет пик на 7 сутки, при этом количество Vi-специфических антителообразующих клеток (АОК) составляет 27,4 АОК на 10⁶ клеток. Было установлено доминирование продукции анти-Vi антител IgG класса, титры которых превышали титры IgM антител. Было показано, что оба препарата Vi-антигена при внутрибрюшинном введении в диапазоне доз 0,2-2,5 мкг/мышь обеспечивали 100% выживаемость при заражении мышей S. typhi Ту-2 №4446 в количестве 1000 клеток/мышь (80 ЛД50).

На 2 этапе выполнения проекта были получены штаммы-продуценты рекомбинантных белковых антигенов-партнеров для конъюгации – дифтерийного анатоксина CRM197, флагеллина fliC и его фьюжн-производного с мембранным белком сальмонелл pagN, экзотоксина А синегнойной палочки repA. Белки-партнеры для конъюгации были наработаны в гетерологичной системе экспрессии в E. coli и очищены методами ВЭЖХ. Уровень продукции белковых антигенов-партнеров составил 50-100 мг с литра бактериальной культуры. Были проведены изучение физико-химических характеристик и оценка пирогенности белковых антигенов-партнеров для конъюгации. Чистота белковых препаратов, оцененная на основе методов ДСН-ПААГ с окрашиванием бриллиантовым голубым Кумасси и денситометрии, составила 95 %, а содержание эндотоксина в препаратах не превышало 5 IU на 1 мг белка. Была проведена сравнительная оценка вариантов возможных способов получения конъюгированной вакцины на основе рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа с учетом исследований, проводившихся по аналогичной тематике.

На 3 этапе выполнения работ была проведена разработка нового технического принципа создания конъюгированной вакцины на основе рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа. Были разработаны и получены экспериментальные образцы конъюгированной брюшнотифозной вакцины нового поколения, основанной на использовании химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантными белковыми антигенами - стимуляторами иммунного ответа – CRM197, fliC, rEPA и фьюжн-белком fliC:pagN. Были проведены исследования различных подходов к оценке эффективности конъюгации, создана и зарегистирирована лабораторная методика оценки эффективности конъюгации и качества конъюгатов. С использованием разработанной методики был осуществлен анализ эффективности конъюгации и выхода конъюгата, пригодного для проведения иммунизации.

На 4 этапе были разработаны и апробированы схемы иммунизации лабораторных животных экспериментальными образцами конъюгированной брюшнотифозной вакцины. Была разработана методика анализа иммунного ответа на вакцинацию, предусматривающая определение уровня гуморального ответа методом иммуно-ферментного анализа и исследование количества АОК в селезенке иммунизированных животных. Экспериментальные исследования иммунного ответа, вызванного применением химических конъюгатов белков-иммуностимуляторов с Vi-антигеном S. typhi, показали, что в присутствии белка-партнера максимальный уровень гуморального иммунного ответа достигается на 14 сутки после вакцинации, при этом преобладают антитела класса IgG. Исследовательские испытания протективного эффекта экспериментальных образцов брюшнотифозной вакцины показали, что полученные вакцинные конъюгаты при внутрибрюшинном введении в количестве 50 нг/мышь обеспечивают 100 % выживаемость при заражении мышей S. typhi Ту-2 №4446 в количестве 1000 клеток/мышь (80 ЛД50). По результатам исследований иммунного ответа и протективного эффекта было установлено, что наиболее эффективным кандидатным вакцинным препаратом является экспериментальный образец брюшнотифозной вакцины Vi-ST-fliCpagN.

На 5 этапе была разработана нормативно-техническая документация (проект технических условий, лабораторный регламент) на получение конъюгированной брюшнотифозной вакцины. Были проведены обобщение и выводы по результатам выполнения проекта и разработан проект технического задания на проведение ОКР по созданию нового типа брюшнотифозной вакцины, основанной на использовании химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном-стимулятором иммунного ответа. За счет внебюджетных средств проекта была осуществлена разработка предложений и рекомендаций по реализации (коммерциализации) результатов проекта, вовлечению их в хозяйственный оборот и проведена подготовка стендового сообщения для III Всероссийской научно-практической конференции «Исследования и разработки – 2016».

Изданием «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии» выпущены статьи «Современные представления о механизме активации иммунного ответа конъюгированными полисахаридными вакцинами» (авторы А.В. Колесников, А.В. Козырь, И.Г. Шемякин, И.А. Дятлов), «Синтетическая биология как инструмент для разработки инновационных вакцин для профилактики бактериальных инфекций» (А.В. Колесников, А.В. Козырь, И.Г. Шемякин, Л.А. Лисицкая, М.А. Марьин, А.К. Рябко, И.А. Дятлов), «Белки и другие возможные носители для создания конъюгированных вакцин: свойства и применение» (Л.А. Лисицкая, А.В. Колесников, А.В. Козырь, И.Г. Шемякин, А.К. Рябко, О.Н. Красавцева, И.А. Дятлов). Три статьи по теме проекта подготовлены в 2016 году. В 2015 и 2016 гг. по теме разработки зарегистрированы три патентные заявки.

За счет внебюджетных средств проекта, предоставленных ФБУН ГНЦ ПМБ и Индустриальным партнером проекта компанией «ГРИТВАК», проводилась закупка материалов для исследований. Результаты выполнения проекта были представлены в постерных сообщениях на VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (17-20 марта 2015 г., Москва), на Конгрессе WSPID (18-21 ноября 2015 г., Рио-де Жанейро, Бразилия), на VIII Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (28-30 марта 2016 г., Москва), на Международной научной конференции «Ломоносов 2016» (11-15 апреля 2016 г., Москва) и на отчетных конференциях по реализации Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы».

Состав и качество выполненных работ и полученных результатов соответствуют требованиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Заданию на выполнение работ и Календарному плану выполнения работ, а также нормативной документации. Содержание отчётной документации соответствует требованиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Заданию на выполнение работ и Календарному плану выполнения работ.

Проведенная исполнителями проекта разработка конъюгированной брюшнотифозной вакцины нового поколения на основе Vi-антигена и белка-партнера для конъюгации является полностью инновационным исследованием. Эффективность полученного вакцинного препарата сопоставима с эффективностью наилучших мировых аналогов. Переносом полученной лабораторной технологии на производство будет заниматься ООО «ГРИТВАК».

Акт приема-передачи отчетной документации

Заключение партнера