А.В.Ильинов^1,2, А.Г.Савицкая³, О.Е.Хохлова⁴, Ю.С.Винник¹, О.В.Теплякова¹

¹ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Российская Федерация;
²Частное учреждение здравоохранения «Клиническая больница «РЖД-Медицина» г. Красноярска», Красноярск, Российская Федерация;
³ФГБУН «Государственный научный центр Российской Федерации «Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова» РАН, Москва, Российская Федерация;
⁴ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Оболенск, Московская область, Российская Федерация

Резюме: Цель исследования. Разработать протокол раздельного выделения внеклеточной и геномной ДНК оптимальной концентрации и чистоты на примере микобактерий.
Материалы и методы. В работе были использованы штаммы микобактерий Mycobacterium intracellulare и Mycobacterium avium. Выделение ДНК проводили из культур бактерий в начале экспоненциальной фазы роста. Выделение внеклеточной ДНК с поверхности бактериальных клеток проводили путем инкубации в ТЕ-буфере с последующим мягким центрифугированием. Надосадочную жидкость использовали для получения внеклеточной ДНК, из осадка клеток получали геномную ДНК. Для апробации метода использовали краситель PMAxx™, инкубировали клетки бактерий с PMAxx™ перед выделением ДНК. Полученные образцы использовали как матрицу для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Результаты. Получены образцы внеклеточной и геномной ДНК из M. intracellulare и M. avium с концентрацией и чистотой, оптимальными для проведения ПЦР-РВ. Получены образцы геномной ДНК M. intracellulare (41 нг/мкл) и M. avium (39,2 нг/мкл). Внеклеточная ДНК M. intracellulare получена в концентрации 9,23 нг/мкл, M. avium – 6,1 нг/мкл. Обработка красителем PMAxx™, ковалентно связывающимся с молекулами ДНК, препятствовала амплификации участков. После окраски PMAxx™ проведено количественное определения 16S рРНК и SigA с помощью ПЦР-РВ. Инкубация с PMAxx™ привела к снижению геномной ДНК максимум в 1,8 раза. В образцах внеклеточной ДНК инкубация с PMAxx™ вызвала снижение количества 16S рРНК и SigA в 5 раз.
Заключение. Данный метод применим для получения образцов внеклеточной и геномной ДНК бактерий в необходимых количестве и чистоте для проведения последующего анализа.

Ключевые слова: микобактерии, геномная ДНК, полимеразная цепная реакция, внеклеточная ДНК, пропидиум моноазид

Для цитирования: Ильинов А.В., Савицкая А.Г., Хохлова О.Е., Винник Ю.С., Теплякова О.В. Поэтапное выделение внеклеточной и геномной ДНК на примере микобактерий. Бактериология. 2025; 10(3): 51-55.

DOI: 10.20953/2500-1027-2025-3-51-55

Читать полностью PDF-файл