М.А.Шкуратова, М.А.Марьин, М.М.Рогозин, О.В.Калмантаева, А.Е.Хлынцева, А.К.Сурин, В.В.Фирстова

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Московская область, Оболенск, Российская Федерация

Резюме: Шигатоксин (Stx), продуцируемый Escherichia coli, является основной причиной желудочно-кишечных расстройств, включая геморрагический колит, а также возникновения гемолитико-уремического синдрома. Представители семейства Stx имеют АВ-структуру и состоят из токсичной А-субъединицы и пентамера из рецептор-связывающих В-субъединиц. Для изучения иммунопатогенеза, конструирования диагностических тест-систем, а также при создании терапевтических моноклональных антител необходимо получение рекомбинантного белка. Токсичность А-субъединицы шигатоксина препятствует получению высоких выходов белка за счет снижения плотности клеток культуры и/или ограничения количества белка внутри клетки-продуцента.
В представленной работе была проанализирована экспрессия А-субъединицы шигатоксина 2-го типа шестью разными продуцентами E. coli и синтез В-субъединицы одним продуцентом при различных условиях культивирования. В результате было выявлено, что оптимальная продукция А- и В-субъединиц шигатоксина 2-го типа наблюдалась в составе химерного продукта с SUMO-пептидом штамма E. coli Rosetta (DE3)pLysS.
Экспрессию проводили в установленных в ходе исследования условиях культивирования: продуцента субъединицы А – 20°С, 10 мкМ индуктора, 16 ч; продуцента субъединицы В – 20°С, 100 мкМ индуктора, 16 ч. Фрагмент SUMO-His был удален с помощью протеазы, и в результате работы был получен белок без дополнительных аминокислотных последовательностей. Установленный в ходе исследования алгоритм получения субъединиц использовали для получения целевого белка.
Конечный выход А- и В-субъединиц шигатоксина 2-го типа составил 1,5 и 4 мг с литра культуральной жидкости соответственно. Идентичность рекомбинантных пептидов последовательностям Stx2А и Stx2B подтвердили методом масс-спектрометрии. Доказали функциональную активность полученных белков и образование холотоксина при соединении растворов субъединиц in vitro.

Ключевые слова: шигатоксин 2-го типа, рекомбинантный белок, инактивирующий рибосомы белок, культивирование

Для цитирования: Шкуратова М.А., Марьин М.А., Рогозин М.М., Калмантаева О.В., Хлынцева А.Е., Сурин А.К., Фирстова В.В. Оптимизация условий экспрессии рекомбинантных субъединиц шигатоксина 2-го типа Escherichia coli при использовании различных алгоритмов получения целевого белка. Бактериология. 2024; 9(3): 8-19.

DOI: 10.20953/2500-1027-2024-3-8-19

Читать полностью PDF-файл